人胰島素原(PI)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒使用說(shuō)明

PI簡(jiǎn)介：

胰島素原(PI)是胰島素的前體激素，它是由由胰島β細(xì)胞合成和分泌，主要在腎臟分解代謝。生理情況下，只有極少量的胰島素原釋放入血，在病理情況下，胰島β細(xì)胞釋放胰島素原增多，血中胰島素原水平升高。它是細(xì)胞在裂解成成熟胰島素之前分泌的最后一個(gè)單鏈蛋白結(jié)構(gòu)。它是由芝加哥大學(xué)的Donald F. Steiner教授在1967年發(fā)現(xiàn)的。

實(shí)驗(yàn)原理：

本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被有人胰島素原（PI）捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，HRP酶結(jié)合物，中間經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素原（PI）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成：

試劑盒參數(shù)：

需自備的設(shè)備及試劑： 

1. 450±10nm 濾光片酶標(biāo)儀

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸餾水或去離子水.

5. 脫脂棉吸水紙.

6. 37℃恒溫箱.

8. 準(zhǔn)備若干個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管.

樣本稀釋方案：

請(qǐng)?zhí)崆邦A(yù)估樣本的濃度范圍 ，如果您的檢測(cè)樣本需要稀釋 ，參考稀釋方案如下：

稀釋 100 倍 ：一步稀釋。取 5μL 樣本到 495μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 100 倍稀釋；

稀釋 1000 倍： 兩步稀釋 。 取 5μL 樣本到 95μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 20 倍稀 釋 ，再取 5μL 20 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋 1000 倍；

稀釋 100000 倍 ：三步稀釋。取 5μL 樣本到 195μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 40 倍 稀釋 ，再取 5μL 40 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 50 倍稀釋 ，最后 取 5μL 2000 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋100000 倍；

每步稀釋時(shí)取液量不少于 3μL ，稀釋倍數(shù)不超過(guò) 100 倍。每步稀釋都需混合均勻 ，避免起泡。

樣本處理及要求：

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5. 其它生物標(biāo)本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)。

6. 樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

7. 樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

檢測(cè)前準(zhǔn)備工作：

1. 請(qǐng)提10分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

標(biāo)準(zhǔn)品梯度工作液配制：加入1mL通用稀釋液至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為800pg/mL)，然后按照以下濃度：800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、 100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、 12.5pg/mL、0pg/mL進(jìn)行稀釋。

倍比稀釋方法：取7支 EP管，每管中加入500μL通用稀釋液,200pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成100pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔，不需要再?gòu)牡箶?shù)第二管中吸取液體，具體如下圖。

1. 生物素化檢抗工作液配制：使用前15分鐘將濃縮生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，當(dāng)日使用。

2. 酶結(jié)合物工作液配制：使用前15分鐘將100x濃縮酶結(jié)合物于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮HRP酶結(jié)合物稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，當(dāng)日使用。

3. 1×洗滌液配制：取10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可放置室溫，輕搖均勻，待結(jié)晶溶解后再配置)。

操作步驟：

1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100μl每孔加入相應(yīng)孔中，空白孔加入100μL通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時(shí)。（建議：將待測(cè)樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測(cè)試。從而減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)試結(jié)果的誤差影響，最后計(jì)算樣本濃度時(shí)需乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)中建議設(shè)立復(fù)孔）。

3. 加生物素化抗體：取出酶標(biāo)板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液100μL，蓋上封板膜后37℃溫育1小時(shí)。

4. 洗板：棄去液體，每孔加入300μL 1x洗滌液，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板3次（也可用洗板機(jī)洗板）。

5. 加酶結(jié)合物工作液：每孔加入酶結(jié)合物工作液100μL，蓋上封板膜后37℃溫育30分鐘。

6. 洗板：棄去液體按步驟4洗滌方法，洗板5次。

7. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育15分鐘。

8.  加終止液：取出酶標(biāo)板，每孔直接加入終止液50μL，立即在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

結(jié)果判斷：

1. 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)。

2. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)據(jù)和參考曲線：

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試劑盒性能：

1. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。

2. 回收率：在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入3個(gè)不同濃度水平的人PI，計(jì)算回收率

3. 線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人PI，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評(píng)估線性。評(píng)估線性。